שיטות חלבונים – הבדלי גרסאות
תוכן שנמחק תוכן שנוסף
שורה 48:
* '''[[דיאליזה]]''': דיאליזה מבוססת על ההבדל ביכולתם של חומרים שונים לחדור מבעד [[ממברנה סינתטית|ממברנות סינתטיות]]. כאשר תמיסה מכילה פרט לחלבון אותו מעוניינים לחקור גם [[מלח (כימיה)|מלחים]], [[מולקולה|מולקולות]] קטנות או חלבונים קטנים ניתן לנקות את החלבון בעזרת דיאליזה. התמיסה מוכנסת לשקית ממברנה המאפשרת מעבר למולקולות מסוימות (בדרך כלל רק למולקולות קטנות), השקית מוכנסת לכלי גדול המכיל תמיסה עם ריכוז המלחים אליו מעוניינים להגיע, הכלי בו נמצאות התמיסות מעורבל לאורך זמן. בשיטה זאת בסוף התהליך רק החלבונים שאינם עוברים בממברנה נותרים בשקית הדיאליזה, ריכוז החלבונים שאינם עוברים את הממברנה אינו משתנה.
[[תמונה:Vivaspin1.jpg|שמאל|ממוזער|150px|ריכוז חלבונים בעזרת פילטר]]
* '''ריכוז חלבונים בעזרת פילטר''': השיטה מבוססת על ההבדל ביכולתם של חלבונים בעלי גודל שונה לעבור דרך [[סינון|פילטר]], כדי לזרז את התהליך התמיסה מסורכזת ב[[צנטריפוגה]] ב[[כבידה]] של עד עשרות אלפי g. מים, מלחים, מולקולות קטנות וחלבונים קטנים יוצאים מן התמיסה, חלבונים גדולים מן החרירים שבפילטר אינם עוברים וכך ריכוזם של חלבונים אלו עולה. לכל מכשיר ריכוז מוגדר cut off size, הגודל המרבי של חלבונים היכולים לעבור את הפילטר, אם הפילטר יעיל לא יעברו חלבונים גדולים מן הגודל המוגדר. כדי להיפטר באופן יעיל יותר מן החלבונים הקטנים ניתן, לאחר מחזור של ריכוז, לדלל מחדש את הדוגמה ולרכז שוב.
:בניגוד לדיאליזה ריכוז חלבונים בעזרת פילטר אינו מבוסס על מעבר מולקולות באופן דו כיווני דרך ממברנה אלא על מעבר חד כיווני. שוני נוסף הוא שריכוז המלחים בתמיסה אינו משתנה בריכוז על ידי פילטר בניגוד לדיאליזה.
* '''[[השקעת חלבון בעזרת אמוניום סולפט]]''': [[אמוניום סולפט]] הוא [[מסיסות|מלח קל תמס]], היוצר [[קשר מימן|קשרים פולרים]] עם מים, בכך זמינות המים יורדת כך שהמים אינם יוצרים קשרים בין מולקולריים עם החלבונים ([[מיסוך כימי|מיסוך מטענים]]), ללא קשרים אלו החלבון הופך ל[[מוצק]] ושוקע. ניתן להפריד בין ה[[תמיסה]] לחלבון המוצק על ידי סרכוז.
:מכיוון שכל חלבון שוקע בריכוז אמוניום סולפט אופייני (ריכוז קריטי) ניתן לשלוט בתהליך כדי להעשיר את כמותו של חלבון ספציפי, וזאת בשני שלבים - ראשית להשקיע ולהוציא חלבונים שהריכוז הקריטי שלהם נמוך מזה של החלבון הרצוי. לאחר מכן להשקיע בריכוז הקריטי של החלבון הרצוי. בדרך כלל לאחר ההשקעה החלבונים מומסים שנית ומנוקים בדיאליזה כדי להיפטר משאריות אמוניום סולפט.
:השיטה יעילה מאוד בריכוז והעשרה של תמיסות חלבונים, החיסרון שבשיטה הוא שהניקוי אינו מלא - אם בתמיסה חלבונים בעלי ריכוז קריטי קרוב ההפרדה לא תהיה מלאה. חיסרון נוסף בשיטה היא שהשקעת חלבונים עלולה לפגוע בתפקוד החלבון.
שורה 62:
[[תמונה:Cb-IgG.jpg|שמאל|ממוזער|150px|'''אלקטרופורזה של חלבונים על SDS-PAGE''']]
על ידי שדה חשמלי ניתן להפריד [[מולקולה|מולקולות]] על פי מאפיינים פיזיקליים כמו גודל, משקל, או [[מטען חשמלי]]. המולקולות מונחות על [[ג'ל]], ו[[שדה חשמלי]] שמופעל גורם למולקולות לנוע בג'ל בהתאם [[מטען חשמלי|למטענן החשמלי]]. בהקשר להפרדות חלבונים ניתן להשתמש בשיטה כדי לאפיין שני משתנים: גודל החלבון ומטענו.
* '''[[SDS-PAGE]]''': השיטה המקובלת ביותר למציאת גודלם של חלבונים היא על ידי [[SDS-PAGE]]: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis השיטה מבוססת על הרתחת חלבונים ב-[[סודיום דודציל סולפט]] - מולקולת [[דטרגנט]] טעונה שלילית. SDS פותח את המבנה המרחבי של החלבונים ונותן לכל החלבונים בדוגמה מטען שלילי. הדוגמה מונחת על [[ג'ל]] [[פוליאקרילאמיד]] ליד ה[[אלקטרודה]] השלילית, עם הפעלת שדה חשמלי החלבונים נעים לכיוון האלקטרודה החיובית. החלבונים מופרדים מאחר שחלבונים כבדים נעים בג'ל לאט יותר מחלבונים קלים. לאחר ההפרדה ניתן לצבוע את כלל החלבונים בג'ל בשיטת [[קומסי]] (Coomassie blue) או [[בצביעת כסף]] (Silver staining). לחלופין ניתן למצוא חלבון ייחודי בעזרת [[תספיג חלבון]] (ראו לעיל).
* '''[[מיקוד איזואלקטרי]] Isoelectric focusing''': שיטה המבוססת על אלקטרופורזה של חלבונים למציאת [[הנקודה האיזואלקטרית]]. דוגמת חלבונים מונחת על ג'ל פוליאקרילאמיד ללא SDS. מכיוון שהחלבונים לא עברו טיפול ב-SDS מטענם החשמלי וכושר התנועה שלהם בשדה החשמלי נקבעים על פי רצף חומצות האמינו בלבד. הג'ל בנוי ב[[גרדיאנט]] [[pH]], כאשר חלבון מגיע ל-pH הנמצא בנקודה האיזואלקטרית הוא מאבד את מטענו החשמלי ובכך מאבד את כושר התנועה.
[[תמונה:2D gel1.jpg|שמאל|ממוזער|250px|ג'ל דו ממדי]]
| |||