RT-PCR – הבדלי גרסאות
תוכן שנמחק תוכן שנוסף
עד שהערך יכתב עדיף להפנות אותו לערך האם. |
אין תקציר עריכה |
||
שורה 1:
'''רוורס טרמסקרישן PCR''' (באנגלית '''Reverse transcription polymerase chain reaction'''), תרגום מילולי- שיעתוק הפוך- תגובת שרשרת של פולימראז) או RT-PCR היא טכניקה המשמשת בביולוגיה [[מולקולארית]] הגברת רצפי [[RNA]]. הטכניקה מבוססת על [[שיעתוק הפוך]] של רצפי RNA ל [[DNA]] ולאחר מכן [[PCR]]- הכפלת מקטע DNA ספציפי מספר רב של פעמים ליצירת [[אמפליקון]].
==רקע==
בכל היצורים המידע הגנטי אצור בDNA [[גנום|הגנומי]]. הDNA מכיל [[גן|גנים]] המקודדים לחלבונים וכן מקטעים ארוכים שאינם מקודדים לחלבונים. בכל היצורים אין כל הגנים מבוטאים (כלומר משועתקים ל mRNA) באותה העת. כך לדוגמה, ב[[חיידקים]] מבוטאים גנים לפירוק חומרי תזונה שונים (כמו [[לקטוז]]) רק כאשר החומר מצוי בסביבת החיידק. באופן דומה, ביצורים [[רב תאיים]] חלבונים שונים מבוטאים בסוגים שונים של תאים, כך לדוגמה [[אינסולין]] מיוצר אך ורק ב[[תאי לנגהרסט]] שב[[לבלב]]. מאחר שmRNA מתורגם לחלבון יש חשיבות רבה בחקר ריצפו, רק על ידי בדיקת רצף mRNA ניתן רצף החלבון כיוון שרצף ה DNA מכיל אלמנטים שאינם מבוטאים בחלבון כגון אינטרונים בנוסף גנים רבים עוברים שיחבור חלופי כך שרצף DNA יחיד יכול ליצור מספר חלבונים.
==טכניקת RT-PCR ==
RT-PCR מבוסס על שני שלבים עיקריים:
1- שיעתוק הפוך- הפיכת RNA ל DNA משלים – cDNA בעזרת אנזים רוורס טראנסקריפטאז המופק מוירוס משפחת רטרו וירוסים כגון M-MLV האנזים משמש את הוירוס בהפיכת RNA ויראילי לDNA כחלק ממחזור החיים של הוירוס. פרט לאנזים מכילה הריאקציה RNA, נוקליאוטידים (dNTP), בופר, ופריימר: בתגובת RT-PCR מקטע DNA קצר נקשר לקצהו של ה RNA- פריימר, כאשר ידוע מקטע הRNA הרצוי הפריימר יהיה ההופכי המשלים שלו, כאשר לא ידוע המקטע או יש עניין במספר מקטעים המקודדים לחלבון ניתן להשתמש בפריימר המכיל רצף בן 15-25 חומצות גרעין של תימין – poly dT. פריימר זה נקשר ל mRNA באתר הפולי אדנילציה. כאשר מקטע הmRNA אינו מקודד לחלבון ולכן אינו מכיל אתר פולי אדנילציה כמו ב RNA רגולטורי, או tRNA יש להשתמש בפרימרים אקראיים.
בסיום השלב יש לחמם את תערובת הריאקציה ל 95 מעלות כדי לפרק את הקשר בין ה DNA לRNA.
2- PCR- לאחר יצירת cDNA ניתן השתמש בו כתבנית לPCR כמו כל DNA. ריאקצית PCR מכילה: אנזים TAQ-polimerase, נוקליאוטידים, שתי פרימרים, cDNA ובופר מתאים. הריאקציה מורכבת ממספר מחזורים – בד"כ 20-40 בני שלושה שלבים כל אחד- דנטורציה (בטמפרטורה 95 מעלות), אנילינג (בטמפרטורה 55-65 מעלות בדרך כלל) ופולימריזציה (טמפרטורה של 72 מעלות).
| |||