פריימר דיימר
פריימר דיימר (Primer Dimer) הוא תוצר לוואי פוטנציאלי בריאקציית שרשרת של פולימראז (PCR), טכניקה שימושית בביולוגיה מולקולרית. פריימר דיימר הם צמד פריימרים מחוברים. פריימר דיימר נוצרים כאשר שני פריימרים בPCR עוברים היברידיזציה אחד לשני (self-annealed) וגורמים להכפלה עצמית, במקום להכפלת עותקי התוצר המבוקש, על ידי הדנ"א פולימראז. פריימר דיימר עלולים להפריע לריאקציה המקורית בעיקר מפני שהם צורכים את חומרי הגלם במבחנה, לעיתים עד כדי עיכוב הראקציה המקורית. פריימר דיימר מהווים בעיה משמעותית כאשר מספרם קרוב או עולה על מספר מולקולות המטרה אותן מנסים להגביר, דבר הקורה בעיקר בהגברת מספר קטן של עותקי מולקולת מטרה. במקרה של Real Time PCR עלולים הפריימר דיימר לגרום לשגיאה בכימות מולקולת המטרה.
מנגנון היווצרות פריימר דיימר עריכה
מבחינים בין שני מנגנוני היווצרות של פריימר דיימר. מנגנון ראשון שהוא יצור פריימר דיימר משני פריימרים (שלב I ו-II באיור), ומנגנון שני של הכפלת פריימר דיימר קיימים (שלב III באיור), ומבוסס על תוצרי המנגנון הראשון.
בשלב I עוברים שני פריימרים היברידיזציה אחד לשני רק בקצה ה-3' שלהם. כאשר חיבור הקצוות יציב מספיק כדי לאפשר ל-דנ"א פולימראז להתחבר למבנה, שתי מולקולות אנזים יתחברו לשני קצוות 3' ויאריכו אותם, עד לקבלת המבנה המתואר בשלב II. הגורם העיקרי התורם להגברת יציבות מבנה כזה הוא שכיחות גבוהה של נוקלאוטידים מסוג GC בקצה ה-3' של שני הפריימרים, מכיוון ש G ו-C נקשרים זה לזה בשלושה קשרי מימן לעומת A ו-T הנקשרים באמצעות שני קשרי מימן בלבד.
השלב ה-III מתרחש במחזור ההכפלה הבא, כאשר תוצר ההכפלה מהמחזור הקודם מתחבר כעת בקלות לפריימר המשלים שלו, מכיוון שהוא מכיל את הרצף כולו ולא רק את קצה ה-3'. משלב זה הכפלת הפריימר דיימר מתרחשת ביעילות שווה, או אפילו גבוהה, מיעילות הכפלת רצף המטרה.
זיהוי פריימר דיימר עריכה
ניתן לזהות קיום פריימר דיימר באמצעות הרצה של תוצר הראקציה בג'ל אגרוז באמצעות אלקטרופורזה. פריימר דיימר יופיעו כ'בנד' שאורכו כ-30-50 בסיסים, תלוי באורך הפריימרים. גילוי בג'ל הוא האפשרות הפחות מועדפת מחשש לזיהום המעבדה בתוצרי PCR בעת העבודה. הדרך המקובלת היא להריץ את ראקציית ה-PCR עם SYBR Green I צבע פלואורסצנטי ייעודי ל-DNA דו גדילי, אך ללא ספציפיות לרצף, ובסוף הראקציה לבצע Melting curve analysis. הפריימר דיימר, שהם קצרים מרצף המטרה ייפרדו בטמפרטורה נמוכה יותר ויצרו פיק אופייני.
התמודדות עם פריימר דיימר עריכה
אחת הגישות המוקדמות להתמודדות עם פריימר דיימר הייתה כיול כימי-פיזיקאלי של המערכת, כלומר שינוי ריכוזי הפריימרים, הנוקלאוטידים, המגנזיום כלוריד והטמפרטורה של הראקציה. גישה זאת, גם אם עובדת לעיתים, סובלת מכשל מובנה. שינוי אותם פרמטרים המפחיתים את הופעת הפריימר דיימר גורם גם להפחתת יעילות מערכת ה-PCR עצמה. מסיבה זאת פותחו גישות שנועדו להפחית את יעילות יצירת הפריימר דיימר באופן ספציפי. ההתמודדות עם פריימר דיימר משלבת שיטות מגישות שונות.
תוכנות לעיצוב פריימרים עריכה
תכנון פריימרים הוא משימה מורכבת הדורשת התייחסות לשני סוגי פרמטרים, ביולוגיים ופיזיקאליים. הפרמטרים הביולוגיים מתמקדים בספציפיות של מערכת ה-PCR. לדוגמה, ספציפיות ל-RNA של הגן, ספציפיות ל Alternative splicing, ספציפיות לאורגניזם במקרה של וריאנטים דומים של הגן באורגניזמים שונים (נפוץ בעיקר בהבחנה בין זנים שונים של חיידקים ונגיפים) ועוד. לעומת הפרמטרים הביולוגים, מטרת השינויים בפרמטרים הפיזיקאלים היא הפחתת יצירת פריימר דיימר והגברת יעילות הראקציה. בין הפרמטרים הפיזיקאלים הנלקחים בחשבון ניתן למנות אחוז נוקלאוטידים מסוג GC, כך שלא יעלה על 60-70%, ובעיקר לא בקצה ה-3'; טמפרטורת היתוך דומה של הפריימרים; מציאת רצף להגברה עם קצוות שלא יצרו מבנים עצמיים יציבים בצורת Stem-loop; קומפלמנטריות נמוכה בין הפריימרים ואורך רצף בין 60 ל-200 בסיסים.
לרשימה מקיפה של תוכנות חינמיות ומסחריות לתכנון פריימרים ראה את עמוד תכנון הפריימרים של המרכז לגנטיקה אנושית וקלינית במרכז הרפואי האוניברסטאי לינדן (הולנד)[1].
מניעת היווצרות פריימר דיימר לפני תחילת הראקציה עריכה
היכולת של רצפי DNA להתחבר אחד לשני תלויה במידת ההתאמה של הרצפים (קומפלמנטריות), באורכם, בחוזק היוני של התמיסה, בריכוז הפריימרים ובטמפרטורה. בגלל שהפריימרים מתוכננים כך שיהיו עם קומפלמנטריות נמוכה אחד לשני, הם יכולים להתחבר אחד לשני (שלב I באיור) בעיקר כאשר תערובת הראקציה נמצאת בטמפרטורה נמוכה, קרי, לפני תחילת הראקציה. האנזים Taq polymerase או קרובים לו המשמשים ב-PCR, מיועדים לעבודה בטמפרטורה גבוהה (עד מעל ל-90 מעלות צלזיוס), אך הוא עדיין פעיל בטמפרטורה נמוכה (חדר), גם אם בקצב נמוך יותר. לכן, כאשר תערובת הראקציה נמצאת בטמפרטורת חדר יש סיכוי גבוה להתרחשות שלבים I ו-II. כדי להפחית היווצרות פריימר דיימר לפני שמבחנת הראקציה מגיעה לטמפרטורה גבוהה, בה כמעט ולא נוצרים פריימר דיימר מחדש, מפרידים את האנזים מהראקציה, או מעכבים את פעילות האנזים עד שהראקציה מגיעה לטמפרטורת עבודה. גישה זאת נקראת hot start וקיימות מספר דרכים שונות לביצועה.
ואקס - בשיטה זאת מפרידים את האנזים מתערובת הראקציה באמצעות ואקס הנמס בטמפרטורה גבוהה ומאפשר את התערבבות האנזים עם שאר הראגנטים.[2].
שחרור מושהה של מגנזיום - בשיטה זו מוסיפים לתערובת הראקציה רכיב המשחרר יוני מגנזיום לתמיסה רק עם עליית הטמפרטורה[3]. מכיוון שפעילות ה-DNA Polymerase תלויה בנוכחות יוני מגנזיום באתר הפעיל של האנזים[4] הוספת יוני מגנזיום לראקציה רק כאשר התערובת מגיעה לטמפרטורה הרצויה תפחית היווצרות פריימר דיימר.
קשירה לא קוולנטית של מעכב - בשיטה זאת פפטיד, נוגדן[5] או אפטמר[6], נקשרים לאנזים בטמפרטורה נמוכה ומעכבים את פעולתו, אך מתנתקים ממנו בהדגרה של דקה עד חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס ומאפשרים את הפעלתו מחדש. עם זאת, הקשר הלא קוולנטי בין האנזים למעכב מאפשר למעכב להיקשר לאנזים כאשר הטמפרטורה יורדת במהלך ה-PCR, דבר שעלול לגרום באופן חלקי לדאקטיבציה חוזרת של האנזים.
Taq polymerase שאינו עובד בטמפרטורות נמוכות - זהו אנזים מוטנטי שאיבד כמעט את כל יכולתו לפעול בטמפרטורת חדר[7].
מודיפיקציה כימית - בשיטה זאת מבצעים מודיפיקציה קוולנטית על שייר חומצה אמינית, בדרך כלל באתר הפעיל של האנזים. לפני תחילת הראקציה יש לחמם את תערובת הראקציה למשך 10-15 דקות על מנת לשחרר את המודיפיקציה הקוולנטית[8].
דאקטיבציה של הפריימרים - בשיטה זאת מוסיפים לתערובת הראקציה רכיב הנקשר באופן ספציפי ל-DNA חד גדילי, לדוגמה Gene 32 protein[9]. כאשר מחממים את תערובת הראקציה החלבון נהרס, משתחרר מן הפריימרים ובכך משפעל אותם. שיטה זאת כמעט ואינה בשימוש כיום מכיוון שהיא דורשת זמן להדגרת הפריימרים עם החלבון.
מניעת הופעת אות הנוצר מפריימר דיימר (ב real-time PCR) עריכה
גישה אחרת להתמודדות הבעיה במקרה של real-time PCR, היא על ידי מניעת הופעת אות מהפריימר דיימר. כל הפתרונות בגישה זאת אינם פותרים את הבעיות העלולות להיגרם מהפריימר דיימר, קרי, עיכוב הראקציה או השפעה על התוצאה.
מדידת אות פלואורסצנטי בטמפרטורה גבוהה - כאשר מבצעים ראקציית Real Time PCR עם SYBR Green I, צבע לא ספציפי ל-DNA דו גדילי, ניתן בדרך כלל להפחית את קריאת האות המתקבל מהפריימר דיימר באמצעות העלאת טמפרטורת קריאת האות כך שתהייה מעט מתחת לנקודת ההתכה של רצף המטרה ומעל נקודת ההתכה של הפריימר דיימר[10].
שימוש ב-sequence specific probes - כגון molecular beacon, TaqMan מאפשר קבלת סיגנל מרצף המטרה בלבד.
מודיפיקציה מבנית של פריימרים עריכה
גישה אחרת להתמודדות עם פריימר דיימר היא באמצעות הכנסת שינויים בפריימרים. HANDS - Homo-Tag Assisted Non-Dimer System (HANDS)[11], היא שיטה בה מוסיפים לפריימר בקצה ה-5' זנב של מספר בסיסים המשלימים לקצה ה-3' של אותו הפריימר. כאשר פריימר כזה נמצא חופשי בתמיסה הקצוות שלו מתחברים אחד לשני ויוצרים מבנה Stem-loop, שאינו זמין להתחברות לפריימרים אחרים.
פריימר כימרי - בשיטה זאת מכניסים לתוך רצף ה-DNA של הפריימר מספר מועט של בסיסי RNA[12]. תוצר ה-PCR של פריימרים אלו מכיל RNA בצד שמכיל את הפריימר (צד 5'), אך בצד ה-3' הוא כולו DNA. לכן, כאשר במחזור הבא יתחבר לתוצר ה-PCR פריימר חדש בצד ה-3' הוא יתחבר ל-DNA בלבד. לעומת זאת כאשר פריימר יתחבר לפריימר אחר ייווצר קומפלקס דו גדילי שכל גדיל מורכב מ-DNA-RNA. מכיוון שקומפלקס דו-גדילי של DNA-RNA עם DNA-RNA הוא פחות יציב נוצרים פחות פריימר דיימר.
ראו גם עריכה
קישורים חיצוניים עריכה
הערות שוליים עריכה
- ^ The primer design page of Leiden University Medical Center
- ^ US Patent number 5413924
- ^ US Patent application number 2007/0254327
- ^ Critical role of magnesium ions in DNA polymerase beta's closing and active site assembly
- ^ US Patent number 5338671
- ^ US Patent number 6183967
- ^ US Patent number 6214557
- ^ US Patent number 5677152
- ^ Improved yields of long PCR products using Gene 32 protein
- ^ Four steps PCR
- ^ The elimination of primer-dimer accumulation in PCR
- ^ Chimeric primers for improved nucleic acid amplification reactions