RT-PCR – הבדלי גרסאות

'''רוורס טרנסקריפשן PCR''' (באנגלית '''Reverse transcription polymerase chain reaction'''), תרגום מילולי- שיעתוק הפוך- תגובת שרשרת של פולימראז) או RT-PCR היא טכניקה המשמשת ב[[ביולוגיה מולקולרית]] הגברת רצפי [[RNA]]. הטכניקה מבוססת על [[שיעתוק הפוך]] של רצפי RNA ל [[DNA]] ולאחר מכן [[PCR]]- הכפלת מקטע DNA ספציפי מספר רב של פעמים ליצירת [[אמפליקון]].

== רקע ==

בכל היצורים המידע הגנטי אצור בDNA [[גנום|הגנומי]]. הDNA מכיל [[גן (ביולוגיה)|גנים]] המקודדים לחלבונים וכן מקטעים ארוכים שאינם מקודדים לחלבונים. בכל היצורים אין כל הגנים מבוטאים (כלומר משועתקים ל mRNA) באותה העת. כך לדוגמה, ב[[חיידקים]] מבוטאים גנים לפירוק חומרי תזונה שונים (כמו [[לקטוז]]) רק כאשר החומר מצוי בסביבת החיידק. באופן דומה, ביצורים [[רב תאיים]] חלבונים שונים מבוטאים בסוגים שונים של תאים, כך לדוגמה [[אינסולין]] מיוצר אך ורק ב[[תאי בטא]] שב[[לבלב]]. מאחר שmRNA מתורגם לחלבון יש חשיבות רבה בחקר ריצפו, רק על ידי בדיקת רצף mRNA ניתן רצף החלבון כיוון שרצף ה DNA מכיל אלמנטים שאינם מבוטאים בחלבון כגון [[אינטרון|אינטרונים]] בנוסף גנים רבים עוברים [[שיחבור חלופי]] כך שרצף DNA יחיד יכול ליצור מספר חלבונים.

== טכניקת RT-PCR ==

1- שיעתוק הפוך- הפיכת RNA ל DNA משלים – [[cDNA]] בעזרת [[אנזים]] [[רוורס טרנסקריפטאז]] המופק מ[[נגיף|וירוס]] משפחת [[רטרו וירוס|רטרו וירוסים]]ים כגון [[M-MLV]] האנזים משמש את הוירוס בהפיכת RNA ויראילי לDNA כחלק ממחזור החיים של הוירוס. פרט לאנזים מכילה הריאקציה RNA, [[נוקלאוטידים|נוקליאוטידים]] (dNTP), [[בופר]], ופריימר: בתגובת RT-PCR מקטע DNA קצר נקשר לקצהו של ה RNA- פריימר, כאשר ידוע מקטע הRNA הרצוי הפריימר יהיה ההופכי המשלים שלו, כאשר לא ידוע המקטע או יש עניין במספר מקטעים המקודדים לחלבון ניתן להשתמש בפריימר המכיל רצף בן 15-25 חומצות גרעין של [[תימין]] – poly dT. פריימר זה נקשר ל mRNA באתר ה[[פולי אדנילציה]]. כאשר מקטע הmRNA אינו מקודד לחלבון ולכן אינו מכיל אתר פולי אדנילציה כמו ב [[small RNA]], או [[tRNA]] יש להשתמש בפרימרים אקראיים.

2- PCR- לאחר יצירת cDNA ניתן השתמש בו כתבנית לPCR כמו כל DNA. ריאקצית PCR מכילה: אנזים