משתמש:Nognogita8/אמונפלורסנט

אמונפלורסנט

אמונפלורסנט הינה טכניקה המשתמשת במיקרוסקופ פלורסנטי ומשמשת בראש ובראשונה לדגימות מיקרוביולוגיות. טכניקה זו משתמשת בספציפיות של נוגדנים לאנטיגנים שלהם כדי למקד את צבעי הפלורסנט למטרות ביו-מולקולריות ספציפיות בתוך התא, וכך לאפשר הדמיה של החלוקה של מולקולת היעד דרך הדגימה. אמונפלורסנט הינה דוגמא בשימוש נרחב של צביעה חיסונית, ודוגמא ספציפית של אימונוהיסטוכימיה שעושה שימוש ב- fluorophores כדי לתת הדמיה של מיקום הנוגדנים.

אמונפלורסנט יכולה להיות שימושית בחלקי רקמה, קווי תאים או תאים ספציפים, או שיכולה להיות שימושית לניתוח חלוקת החלבונים, גליקנים ועוד מולקולותו קטנות ביולוגיות ולא ביולוגיות.

אמונפלורסנט יכולה להיות בשימוש יחד עם שיטות נוספית של צביעה פלורסנטית, למשל, שימוש ב-DAPI על מנת להבחין בדנ"א. מספר עיצובים מקרוסקופים יכולים לשמש לשם ניתוח מדגמים אמונפלורסנטים - הפשוט ביותר הינו מקרוסקופ epifluorescence, והמיקרוסקופיה הקונפוקלית גם היא נמצאת בשימוש רחב. מספר מיקרוסקופים בעלי רזולוציה עצומה, שיכולים לספק תמונה איכותית יותר, נמצאים גם הם בשימוש.

סוגי אמונפלורסנט

ישנם 2 סוגים של טכניקות אמונפלורסנט, ראשונית (ישירה) ומשנית (לא ישירה)

הטכניקה הישירה

אמונפלורסנט ראשונית (ישירה), משתמשת בנוגדן אחד, המקושר כימית לפלורופור. הנוגדן הראשוני מזהה את מולקולת היעד (אנטיגן) ונקשר לאזור ספציפי הנקרא אפיטופ. הפלורופור המצורף יכול להיות מוצג דרך מיקרוסקופ פלורסנטי , אשר, יפלוט אורך גל שונה של אור ברגע שאור יפגע בו. לטכניקת האמונפלורסנט הישיר, על אף שהיא פחות מוכרת, יש יתרונות עצומים על פני הפרוצדורה השניה - אמונפלורסנט משני (לא ישיר). הצירוף הישיר של השליח לנוגן מוריד את מספר השלבים בטכניקה, חוסך זמן, ומוריד רעשים ומסיחים לא ספציפים הנמצאים ברקע. כמו כן, זה מגביל את האפשרות לתגובה חוצת נוגדנים ומקטין סיכוי לשגיאות במהלך התהליך. בכל אופן, כיוון שמספר המולקולות הפלורסנטיות שיכולות להיקשר לנוגדן הראשוני הינו מוגבל, אמונפלורסנט ישיר הוא קצת פחות רגיש מאשר אמונפלורסנט לא ישיר, וייתכן כי ייתן תוצאות שקריות. אמונפלורסנט ישיר דורש שימוש בהרבה יותר נוגדנים ראשוניים, שהנם יקרים ביותר, לעתים אף בסביות 400 דולר למ"ל.

הטכניקה המשנית

אמונפלורסנט משני (לא ישיר) משתמש בשני נוגדנים - נוגדן ראשוני המתקשר באופן ספציפי למולקולת היעד, והנוגדן המשני, אשר מכיל את הפלורופור, מזהה את הנוגדן הראשוני ונדבק אליו. מספר נוגדנים משניים יכולים להיקשר לנוגדן ראשוני יחיד. עובדה זו מאפשר הגברה של האתות על ידי הגדלת מספר מולקולות הפלורופור לכל אנטיגן. שיטה זו מסובכת יותר ודורשת זמן רב יותר מאשר השיטה הראשונית הנ"ל, אך מאפשרת יותר גמישות, כיוון שמגוון של נוגדנים משניים שונים וטכניקות הצגה יכולות להיות בשימוש מול נוגדן ראשוני יחיד.

פרוטוקול זה אפשרי כיוון שהנוגדן מכיל שני חלקים - אזור משתנה (אשר מזהה את האנטיגן) ואזור קבוע (אשר אחראי למבנה של מולקולת הנוגדן). חשוב להבין שהחלוקה הזו הינה מלאכותית, ובמציאות מולקולת הנוגדן הינה שרשרת 4 פוליפפטידית - שתי שרשראות כבדות ושתיים קלות. מדען יכול לייצר מגוון נוגדנים ראשוניים המזהים מגוון אנטיגנים (להם אזורים משתנים שונים), אך לכולם יהיה את אותו אזור קבוע. כל הנוגדנים הללו יהיו מזוהים ע"י נוגדן משני יחיד. מנגנון זה חוסך עלות.

נוגדנים ראשוניים שונים עם אזורים קבועים שונים מיוצרים ב"כ ע"י עלייה בנוגדנים בזנים שונים. למשל, מדען יכול לייצר נוגדנים ראשוניים בעז, אשר מזהים מספר אנטיגנים, ולאחר מכן להשתמש בנוגדנים משניים של ארנב המזהים את האזור הקבוע של הנוגדן של העז. המען יכול לאחר מכן לייצר סדרה שנייה של נוגדנים משניים בעכבר שיוכלו להיות מזוהים ע"י נוגדני קוף. מנגנון זה מאפשר שימוש חוזר של נוגדנים זוגיים בניסויים שונים.

הגבלות

בדומה לכל טכניקות הפלורסנט, בעיה משמעותית עם אמונפלורסנט הינה הלבנת האור. שגיאה בתוצאות הנגרמת מכך יכולה להיחסך על ידי הורדת עוצמת האור את קיצור משך זמן חשיפתו, על ידי הגדלת הריכוז או ע"י הפעלה של יותר מקורות פלורסנטים שהינם בעלי סיכוי נמוך יותר לגרום להלבנה.

אמונפלורסנט מוגבל רק לתאים מתים, כאשר המבנה על המבנה שבתוך התא פתוח ומוצג, כיוון שנוגדנים לא יכולים לעבור דרך מעטפת התא. חלבונים בsupernatant או בצד החיצוני של קרום התא יכולים להיות מקושרים לנוגדנים. דבר זה מאפשר לתאים החיים להיצבע. בהתאם לקיבוע שבו התשמשו, ייתכן כי החלבונים יהיו בעלי קשרים צולבים, דבר היכול לגרום לתוצאה שקרית (שלילית או חיובית) בעקבות קישוריות לא ספציפית.

שיטה אלטרנטיבית משתמשת בחלבונים רקומביננטים המכילים אזורים של חלבונים פלורסנטים, למשל, חלבון פלורסנטי ירוק (GFP). שימוש בחלבונים "מסומנים" כאלו, מאפשר קביעה של המיקום שלהם בתוך התאים החיים. על אף שנראה שזו דרך חלופית טובה לאמונפלורסנט, על התאים לעבור טרנספקציה או טרנסדוציה (transfection or transducion) עם תיוג GFP, וכתוצאה מכך הם הופכים לאורגניזמים שדורשים תקני אבטחה מחמירים במעבדה.