משתמש:Sivansivan/מעבר אנרגית תהודה על שם פורסטר (FRET)

מעבר אנרגית תהודה על שם פורסטר או מעבר אנרגיה לא קרינתי (באנגלית: FRET- Förster Resonance Energy Transfer או Fluorescence resonance energy transfer) - שיטה לתיאור העברת אנרגיה בין 2 כרומופורים [8] למדידת מרחקים קצרים בין מולקולות ברזולוציה גבוהה [להשלים].

השיטה מבוססת על פלורסנציה של 2 כרומופורים שונים כאשר אחד מהכרומופורים תורם אנרגיה (באנגלית: donor) והשני מקבל אנרגיה (באנגלית: acceptor). האינטראקציה בין תורם האנרגיה למקבל האנרגיה הינה אינטראקציית דיפול-דיפול ולכן יעילות העברת האנרגיה בין המולקולות הפלורסנטיות מבוססת על המרחק ביניהם [4].

היסטוריה עריכה

התיאוריה הבסיסית של אנרגיית תהודה על שם פורסטר פותחה על-ידי תאודור פוסרטר בשנת 1948 ולאות כבוד מכונה השיטה על שמו [5]. לעיתים מכונה השיטה גם מעבר אנרגיה לא קרינתי לאור העובדה שיש אינטראקציה בין כרומופור תורם אנרגיה לכרומופור מקבל אנרגיה שאינה תלויה במעבר פוטונים. למרות התפתחות התיאוריה ב-1948, רק בשנת 1963 זוהתה התופעה באופן ניסיוני, על-ידי החוקר הישראלי, פרופ' מאיר וילצ'ק, שהציג העברת אנרגיה בין 2 חומצות אמינו פלורסנטיות בפפטיד קצר [7]. תימוכין ניסיוני נוסף לתיאוריה של פורסטר התקבל בניסויים שערכו החוקרים Stryer ו- Haugland בסליל של אוליגופרולין [10]. כמו כן, לא איחרו להגיע, תמיכות לתיאוריה מחוקרים ישראלים נוספים ביניהם יצחק שטיינברג (1971) [11] ואלישע האס (2005) [1].

השיטה עריכה

תיאוריה בסיסית עריכה

תהליך מעבר אנרגית תהודה על שם פוססטר מתרחש בעקבות עירור הכרומופור תורם האנרגיה הודות למקור פוטונים. העירור מוביל לשינוי מבני בכרומופור וליצירת שדה מגנטי הנמצא ברזוננס עם השדה המגנטי של הכרומופור מקבל האנרגיה המצוי במצב יסוד (ground state) [9].

תהליך מעבר אנרגית תהודה על שם פורסטר בין מולקולה התורמת אנרגיה למולקולה המקבלת אנרגיה אפשרי כאשר מתקיימים התנאים הבאים [6]: 1. המולקולה תורמת האנרגיה והמולקולה המקבלת אנרגיה חייבות להיות פלורסנטיות. 2. קיימת חפיפה בין ספקטרום הפליטה מהמולקולה תורמת האנרגיה לספקטרום הבליעה של המולקולה מקבלת האנרגיה. 3. המרחק בין המולקולה שתורמת אנרגיה למולקולה המקבלת אנרגיה הוא 1-10 ננומטר (במטרה לאפשר אינטראקציות דיפול-דיפול).

בקיום התנאים, הגדיר פורסטר קבוע קצב, $K_{T}$ , לתיאור העברת האנרגיה: $K_{T}=1/\tau _{D}*(Ro/r)^{6}$

$\tau _{D}$ מתאר את זמן החיים של פלוסנציית המולקולה תורמת האנרגיה, Ro מתאר את רדיוס פורסטר - המרחק בו מתקיים 50% ניצולת העברת אנרגיה, r הינו מרחק הדיפול-דיפול.

רדיוס פורסטר מתואר לפי:

$R_{0}^{6}={\frac {9\,Q_{0}\,(\ln 10)\kappa ^{2}\,J}{128\,\pi ^{5}\,n^{4}\,N_{A}}}$

כאשר, $Q_{o}$ הינו הניצולת הקוונטית של הפלורסנציה בהיעדר מקבל אנרגיה, $k^{2}$ הוא פקטור האורנטציה בין שני הסמנים כאשר אם הסמנים חופשיים ניתן להניח שיש מיצוע ולכן מציבים בפקטור האוריינטציה ערך של 2/3, $n$ הינו מקדם השבירה של התווך, $N_{A}$ הוא מספר אבוגדרו ו- $J$ הינו תחום החפיפה הספקטרלית המחושב באופן הבא: $J=\int f_{\rm {D}}(\lambda )\,\epsilon _{\rm {A}}(\lambda )\,\lambda ^{4}\,d\lambda$

$f_{\rm {D}}$ הינו תיקנון ספקטרום פליטת תורם האנרגיה, $\lambda$ הינה אורך הגל ו- $\epsilon _{\rm {A}}$ הינו מקדם בליעה מולרי.

היחס בין רדיוס פורסטר ליעילות העברת האנרגיה, E, ניתן לתיאור לפי: $E={\frac {1}{1+(r/R_{0})^{6}}}\!$

ולכן ניתן לבטא את יעילות העברת האנרגיה גם בתלות בניצולת הקוונטית בנוכחות ( $Q'_{D}$ ) או בהיעדר מקבל האנרגיה ( $Q_{D}$ ) או ביטוי ביחס לאורך חיי הפלורסנציה של המולקולה תורמת האנרגיה בנוכחות ( $\tau '_{D}$ ) ובהיעדר ( $\tau _{D}$ ) מקבל האנרגיה:

$E=1-{\frac {Q'_{D}}{Q_{D}}}\!=1-{\frac {tau'_{D}}{tau_{D}}}\!$

שימושים בשיטת העברת אנרגית תהודה על שם פורסטר עריכה

שיטת מעבר אנרגיה לא קרינתי שימושית בתחומי הביופיזיקה, ביולוטכנולוגיה, ביולוגיה מולקולרית ותחומים מדעיים נוספים. השיטה משמשת לאיתור אינטראקציות חלבון-חלבון, אינטראקציות חלבון-דנ"א ובחינת שינויים מבניים בחלבונים באמצעות האינטראקציה הנוצרת בין המולקולה תורמת האנרגיה למולקולה המקבלת אנרגיה. ישנן מספר דרכים למדידת יעילות ניצולת מעבר אנרגיה לא קרינתי :

1. מדידות במצב יציב (steady state): עירור קבוע של המולקולה תורמת האנרגיה מאפשר לבחון את יעילות העברת האנרגיה בינה לבין המולקולה המקבלת אנרגיה. בשיטה זו מודדים את האנרגיה הנפלטת בתחום הספקטרלי של פליטת האנרגיה ממקבל האנרגיה, בהיעדר ובנוכחות מקבל אנרגיה. היחס המתקבל בין שניה המצבים הינו יחס הניצולת הקוונטית ולפיו ניתן לחשב את ניצולת העברת האנרגיה. אפשרות נוספת למדידות במצב יציב הינה על-ידי מדידת האנרגיה הנפלטת מתורם האנרגיה בנוכחות ובהיעדר מקבל אנרגיה אומנם בניגוד למצב הקודם, כאן דרושה ביקורת נוספת הכוללת תמיסה המכילה רק את מקבל האנרגיה (ללא תורם האנרגיה).

2. מדידות מובחנות זמן וזמני חיים (time resolve): במדידה זו מעוררים את תורם האנרגיה באמצעות פולסים של פוטונים ולכן ניתן להבחין בזמן הדעיכה הפלורסנטית בנוכחות ובהיעדר מקבל אנרגיה. מדידות אלו מאפשרות לקבל התפלגות מרחקים בין המולקולה תורמת האנרגיה למולקולה מקבלת האנרגיה [12]. יעילות העברת האנרגיה יכולה לנבוע מזמן החיים של הפלורסנציה מתורם האנרגיה כאשר זמן החיים קטן בנוכחות מקבל אנרגיה [13].

יישומים עריכה

1. בדיקת אינטראקציה בין חלבונים: שיטות מולקולריות מאפשרות לאחות חלבון תאי לכרומופור חלבוני כגון הכרומופור GFP (החלבון green fluorescent protein) ותיוג חלבון תאי נוסף לכרומופור חלבוני בעל צבע פלורסנטי שונה כגון RFP (החלבון red flurescent protein). באמצעות צבע הפלורסנציה המתקבל במדידה ניתן לבחון את הקרבה בתוך התא בין 2 החלבונים התאיים הנחקרים, כאשר קרבה בין הכרומופורים המתאורים תוביל לקבלת צבע צהוב. [3]

2. בדיקת אינטראקציות ארוכות טווח בחלבונים: שימוש בחומצות אמינו ארומטיות המצויות באותו החלבון כאשר חומצה אמינית אחת מהווה תורם אנרגיה והאחרת מקבל אנרגיה. במידה והמרחק בין 2 חומצות האמינו גדול, עירור תורם האנרגיה לא ישפיע על מקבל האנרגיה אומנם בקרבה בין 2 חומצות האמינו יוביל לעירור של מקבל האנרגיה על-ידי תורם האנרגיה. הקרבה בין 2 חומצות האמינו יכולה להעיד על אינטראקציה בין 2 חומצות האמינו בתוך החלבון ובמידה והן רחוקות זו מזו מבחינת המבנה הראשוני, יהיה ניתן להסיק על אינטראקציה ארוכת טווח ביניהן[1,2]. שיטה זו אפשרית לביצוע גם באמצעות סמנים כימיים המתקשרים לחומצות אמינו ספציפיות בחלבון.

3. מדידת ריכוזי תוצרים אנזימתיים: איחוי מולקולרי של סמנים פלורסנטים לתת יחידה רגולטורית של אנזים ואיחוי סמן פלורסנטי אחר לתת יחידה קטליטית של אותו אנזים, יאפשר בקרבה ביניהם לצפות בניצולת מעבר אנרגיה שמהווה אינדיקציה לקבלת התוצר האנזימתי בנוכחות סובסטרט מתאים [3].

4. חקר מסלולי מעבר אותות בתא חי ותנועת מולקולות בתא: איחוי חלבונים תאיים לכרומופורים חלבונים וצפייה בתא חי במיקרוסקופ פלורסנטי או קונפוקלי מאפשר לצפות במיקום החלבונים בתא ולתנועה שלהם לאתרים שונים בתא במהלך חיי התא ובעקבות תגובה תאית לסיגנלים שונים.

ראו גם עריכה

שם ערך

לקריאה נוספת עריכה

שם סופר, שם ספר, שם הוצאה, תאריך הוצאה

[1] Haas E. (2005). The Study of Protein Folding and Dynamics by Determination of Intramolecular Distance Distributions and Their Fluctuations Using Ensemble and Single-Molecule FRET Measurements. Chem Phys Chem, 6, 858 – 870. [2] Buchner J., Kiefhaber T. (2008). Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) and Single Molecule Fluorescence Detection Studies of the Mechanism of Protein Folding and Unfolding. Protein Folding Handbook. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, pp 573-627. [3] David L. Nelson and Michael M. Cox', Biosignaling, fifthe edition, L E H N I N G E R PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY, W.H. FREEMAN AND COMPANY, Nw York, pp 432-436. [4] Buchner J., Kiefhaber T. (2008). Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) and Single Molecule Fluorescence Detection Studies of the Mechanism of Protein Folding and Unfolding. Protein Folding Handbook. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, pp 573-627. [5] Förster, Theodor (1948). "Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz" [Intermolecular energy migration and fluorescence]. Annalen der Physik (in German) 437: 55–75. [6] LUBERT STRYER AND RICHARD P. HAUGLAND (1967). ENERGY TRANSFER: A SPECTROSCOPIC RULER. Proc Natl Acad Sci U S A, 58(2):719-26. [7] Edelhoch, H., Brand, L., Wilchek, M. (1967). "Fluorescence studies with tryptophyl peptides". Biochemistry 6 (2): 547–559 [8] Ishikawa-Ankerhold HC, Ankerhold R, Drummen GP (2012). Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules, 17(4):4047-132. [9] Zadran S, Standley S, Wong K, Otiniano E, Amighi A, Baudry M (2012). Fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors: visualizing cellular dynamics and bioenergetics. Appl Microbiol Biotechnol, 96(4):895-902. [10] Michaelis, Jens. "Quantitative Distance and Position Measurement using Single-Molecule FRET". In Bräuchle, Christoph; Lamb, Don Carroll; Michaelis, Jens. Single Particle Tracking and Single Molecule Energy Transfer. Weinheim: Wiley-VCH. pp. 191–214. [11] Steinberg, I. Z. (1971). "Long-range nonradiative transfer of electronic excitation energy in proteins and polypeptides." Annu Rev Biochem 40: 83-114. [12] F. Huang, E. Lerner, S. Sato, D. Amir, E. Haas, and A. R. Fersht (2009). Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer Study Shows a Compact Denatured State of the B Domain of Protein A.. Biochemistry, 48(15):3468-76. [13] Clegg, Robert (2009). Förster resonance energy transfer—FRET: what is it, why do it, and how it's done. Gadella, Theodorus W. J. FRET and FLIM Techniques. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 33. Elsevier. pp. 1–57