RT-PCR – הבדלי גרסאות

'''רוורס טרנסקריפשן{{משמאל לימין|RT-PCR}}''' (באנגליתראשי תיבות של '''Reverse transcription polymerase chain reaction'''), תרגום מילולי: שיעתוק הפוךשעתוק לאחור- תגובת שרשרת של פולימראזפולימראזית) או RT-PCR היא טכניקה מעבדתית המשמשת ב[[ביולוגיה מולקולרית]] להגברת רצפי [[RNA]]. הטכניקה מבוססת על [[שיעתוק הפוךלאחור]] של רצפי RNA ל [[DNA]] ולאחר מכן [[PCR]]- – הכפלת מקטע DNA ספציפי מספר רב של פעמים ליצירת [[אמפליקון]].

בכל היצורים המידע הגנטי אצור בDNAב[[חומצת גרעין|חומצות הגרעין]] [[גנום|הגנומיהגנומיות]]. הDNAרצצף חומצות הגרעין מכילמכילות [[גן (ביולוגיה)|גנים]] המקודדים לחלבוניםל[[חלבון|חלבונים]] וכן מקטעים ארוכים שאינם מקודדים לחלבונים. בכל היצורים אין כל הגנים מבוטאים (כלומר משועתקים ל- [[mRNA]]) באותה העת. כך לדוגמה, ב[[חיידקים]] מבוטאים גנים לפירוק חומרי תזונה שונים (כמו [[לקטוז]]) רק כאשר החומר מצוי בסביבת החיידק. באופן דומה, ביצורים [[רב תאיים]] חלבונים שונים מבוטאים בסוגים שונים של תאים, כך לדוגמה [[אינסולין]] מיוצר אך ורק ב[[תאי בטא]] שב[[לבלב]]. מאחר שmRNAש-mRNA מתורגם לחלבון יש חשיבות רבה בחקר ריצפורצפו, רק על ידי בדיקת רצף mRNA ניתן רצף החלבון כיוון שרצף הDNA מכיל אלמנטים שאינם מבוטאים בחלבון כגון [[אינטרון|אינטרונים]] בנוסף גנים רבים עוברים [[שיחבור חלופי]] כך שרצף DNA יחיד יכול ליצור מספר חלבונים.

1- שיעתוקשעתוק הפוך-לאחר – הפיכת RNA ל -DNA משלים – [[cDNA]] בעזרת ה[[אנזים]] [[רוורס טרנסקריפטאז]] המופק מ[[נגיף|וירוס]] משפחתממשפחת [[רטרו וירוס]]ים כגון [[M-MLV]] האנזים משמש את הוירוס בהפיכת גנום ה-RNA ויראליהנגיפי לDNAל-DNA כחלק ממחזור החיים של הוירוסהנגיף. פרט לאנזים מכילה הריאקציה RNA, [[נוקלאוטידים|נוקליאוטידיםנוקלאוטידים]] (dNTP), [[בופר]], ופריימר: בתגובת RT-PCR מקטע DNA קצר נקשר לקצהו של ה RNA- פריימר, כאשר ידוע מקטע הRNAה-RNA הרצוי הפריימר יהיה ההופכי המשלים שלו, כאשר לא ידוע המקטע או יש עניין במספר מקטעים המקודדים לחלבון ניתן להשתמש בפריימר המכיל רצף בן 15–25 חומצות גרעין של [[תימין]] – poly -dT. פריימר זה נקשר ל -mRNA באתר ה[[פולי אדנילציה]]. כאשר מקטע הmRNAה-RNA אינו מקודד לחלבון ולכן אינו מכיל אתר פולי אדנילציה כמו ב [[small RNA]], או [[tRNA]] יש להשתמש בפרימרים אקראיים.

בסיום השלב יש לחמם את תערובת הריאקציה ל -95 מעלות כדי לפרק את הקשר בין ה -DNA לRNAל-RNA.

2- PCR- – לאחר יצירת cDNA ניתן השתמש בו כתבנית לPCR-PCR כמו כל DNA. ריאקצית PCR מכילה: אנזים [[Taq polymerase]] או אנזים [[DNA פולימראז]] תרמופילי אחר, נוקליאוטידים, שני פרימרים, cDNA ובופר מתאים. הריאקציה מורכבת ממספר מחזורים – בדרך כלל 20–40 בני שלושה שלבים כל אחד: דנטורציה (בטמפרטורה 95 מעלות), אנילינג (בטמפרטורה 55–65 מעלות בדרך כלל) ופולימריזציה (טמפרטורה של 72 מעלות).