נקודה איזואלקטרית
בביוכימיה ובכימיה אנליטית, הנקודה האיזואלקטרית (pI, קיצור באנגלית של Point Isoelectric) של מולקולה היא ערך ה-pH בו נטו המטען של המולקולה הוא אפס אבל היא טעונה במטענים נקודתיים מהקבוצות הפונקציונליות השונות. המונח מתייחס בדרך-כלל לחלבונים.
חומצות האמינו, המרכיבות את החלבונים, עשויות להיות בעלות מטען חשמלי. ישנן מספר קבוצות פונקציונליות המופיעות בחומצות האמינו אשר עשויות לקבל מטען חשמלי:
- קבוצת הקרבוקסיל (COOH) עשויה לאבד את אטום המימן שלה ולהפוך ליון קרבוקסילט (-COO), בעל מטען שלילי של 1-.
- קבוצת האמין (NH2) עשויה לקלוט אטום מימן ולהפוך ליון אמין (+NH3), בעל מטען חיובי של 1+.
- קבוצת הידרוקסיל (OH) וקבוצת סולפהידריל (SH) הן חומצות חלשות מאוד ולכן כמו האספרטית והגלוטמית גם הן מסוגלות לקלוט אטום מימן ולהפוך לאיזואלקטריים כאשר ה- pH יורד מתחת ל-pK שלהן.
קיימות 7 חומצות אמינו בעלות שיירים מסוג זה, העשויים לקבל מטען חשמלי:
- שתי חומצות האמינו החומציות - חומצה אספרטית וחומצה גלוטמית - מכילות קבוצת קרבוקסיל בשייר שלהן. קבוצה זו מסוגלת להפוך ליון שלילי ב- pH נמוך יחסית.
- שלוש חומצות האמינו הבסיסיות - ליזין, ארגינין והיסטידין - מכילות קבוצת אמין בשייר שלהן. קבוצה זו מסוגלת להפוך ליון חיובי.
- השייר של טירוזין מכיל הידרוקסיל, והשייר של ציסטאין מכיל סולפהידריל. קבוצות אלו מסוגלות להפוך ליון שלילי אבל רק ב- pH גבוה יחסית, כלומר הן חומצות חלשות.
איבוד וקליטת אטומי המימן תלויים באופן הדוק ברמת החומציות (ה-pH) בסביבה בה נמצאת חומצת האמינו. בסביבה חומצית קיים עודף של יוני מימן, והם מגיבים עם מולקולות המים ליצירת יוני הידרוניום, +H3O. יוני ההידרוניום אינם יציבים ונוטים למסור את יון המימן שלהם לכל מולקולה ה"מוכנה" לקבלו. לפיכך, בסביבה חומצית, קיים סיכוי גבוה שקבוצות הקרבוקסיל של חומצות האמינו יכילו אטום מימן (כלומר, יופיעו בצורה הנייטרלית COOH ללא מטען חשמלי), ושקבוצות האמין, ההידרוקסיל והסולפהידריל יכילו אף הן אטום מימן עודף ויופיעו בצורתן החיובית, +NH3 לדוגמה.
בסביבה בסיסית, לעומת זאת, קיים עודף של יוני הידרוקסיד (-OH). יונים אלו מושכים אליהם בחוזקה יוני מימן. לפיכך, בסביבה בסיסית, קיים סיכוי גבוה שקבוצות הקרבוקסיל של חומצות האמינו יאבדו אטום מימן (כלומר, יופיעו עם מטען שלילי -COO), ושקבוצות האמין, ההידרוקסיל והסולפהידריל יאבדו אף הן אטום מימן אחד ויופיעו בצורתן הנייטרלית, NH2 לדוגמה.
כדי לחשב את המטען הכולל של חומצת אמינו יש לחבר את סך המטענים הקיימים בה ב-pH מסוים. לדוגמה, ברמת pH של 12 חומצה אספרטית מאבדת יוני מימן מכל הקבוצות האפשריות. ב-pH זה, אם כן, קבוצת הקרבוקסיל שלה שלילית, קבוצת האמין נייטרלית ושייר הקרבורסיל שלילי אף הוא. המטען הכולל של חומצה אספרטית ברמת pH של 12 הוא, לפיכך, 2-.
חישוב הנקודה האיזואלקטרית
עריכהעל מנת לחשב את הנקודה האיזואלקטרית נעשה ממוצע על ערכי ה־pKa של החומר.
תחילה נבדוק באיזה pH לפפטיד יש מטען -1 ובאיזה pH לפפטיד יש מטען +1.
בחישוב ה pI ניקח את הpKa בהם המטען מתחלף מחיובי לשלילי. לדוגמה:
עבור ליזין
מיקוד איזואלקטרי
עריכהמיקוד איזואלקטרי הוא שיטה אנליטית לקביעת ה-pI של חלבונים, וכן להפרדת חלבונים לפי ההבדל ב-pI שלהם תוך שימוש באלקטרופוריזה. בשיטת המיקוד האיזואלקטרי יוצקים על פני משטח זכוכית או פלסטיק ג'ל שבו יוצרים שכבות של חומציות שונה על ידי שימוש בחומצות ובסיסים אורגניים בעלי נקודה איזואלקטרית שונה. בעבר היה מקובל לצקת את הג'ל בתוך צינוריות אך בשנים האחרונות שיטה זו לא מקובלת יותר ורוב המשתמשים בשיטה זו יוצקים את הג'ל על פני משטחי פלסטיק שאליהם מתפלמר הג'ל בקשרים קוולנטיים. החומרים בעלי הנקודה האיזואלקטרית השונה שהוספו לג'ל גם הם נקשרים לג'ל בקשרים קוולנטיים. על פני שכבת הג'ל מוסיפים תערובת של חלבונים ומפעילים מתח חשמלי גבוהה הגורם לכל חלבון לנוע בתוך הג'ל לפי המטען החשמלי שלו, הנקבע לפי ה- pH בסביבתו הקרובה. כך כל חלבון ינדוד למקום בג'ל שבו ה- pH שווה ל-pI של אותו חלבון ושם הוא יעצור. כך נפרדים החלבונים תוך תנועה בשדה אלקטרופורטי עד שהם עוצרים בנקודה האיזואלקטרית שלהם. ניתן לשלב בין מיקוד איזואלקטרי ואלקטרופורזה רגילה של חלבונים המשתמשת ב-SDS כדטרגנט, לשיטה הנקראת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל ומשמשת להפרדת חלבונים על ג'ל. השיטה המשולבת, אשר הומצאה בשנת 1975, מדויקת ויעילה בהרבה משתי השיטות כשהן מיושמות בנפרד והיא מאפשרת הפרדה בין אלפי חלבונים שונים בניסוי אחד.